mRNA技术作为一种前沿的生物技术，展现出巨大的应用潜力。无论是用于疾病的预防还是治疗，从mRNA疫苗到mRNA药物，这项技术为医疗提供了全新的思路。然而，mRNA的发展依然面临诸多挑战，其中最大的难题之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的生成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，会在体内引发免疫反应，从而影响mRNA的安全性和有效性。因此，如何有效减少dsRNA的生成，成为mRNA技术领域亟待解决的重要问题。

传统的解决方案往往依赖复杂的纯化工艺，但这不仅成本高、效率低下，还难以彻底去除微量的dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）中的关键工具，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性（例如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性）被视为dsRNA形成的关键因素。因此，通过定向进化或理性设计改造T7RNAP，成为全球研究团队的努力重点。

重大研究进展

2024年3月3日，我们的团队在FEBS Journal上发表了题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。通过对T7RNAP的工程化改造，我们成功显著降低了体外转录中dsRNA的生成，减少至野生型的18%，同时大幅提升了mRNA的整体效率和质量，推动了基因治疗和疫苗开发领域的迅速发展。

我们结合定向进化与半理性设计的方法，成功筛选出多个高效低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA生成方面表现出色。我们构建了随机突变库，并设计了能实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，利用荧光激活液滴分选（FADS）技术进行超高通量筛选。最终，筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），其dsRNA含量显著低于野生型。

同时，我们通过半理性设计法，构建了十个单点饱和突变库，并应用微孔板筛选技术识别有益突变体。通过使用双探针技术，我们在筛选超过1000个突变体后，发现了Mut11（K180E）和Mut14（A70Q），它们的dsRNA含量显著低于野生型，但未影响转录效率。

优化和应用

为了进一步优化，我们针对关键突变位点构建了DNA重组文库，通过微孔板筛选，最终获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验结果显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅为0.007 ng/μg。这一结果不仅在体外实验中得到了验证，且在细胞实验中表现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率的提升。

在将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11所产生的干扰素β（IFN-β）的mRNA及蛋白表达量仅为野生型的97%和1293 pg/mL。进一步在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数量显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA生成有效解除PKR介导的翻译抑制，释放了mRNA的治疗潜力。

研究意义

为了深入解析突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验表明，突变体通过降低RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性，从而减少dsRNA的产生。这一发现为今后进一步优化T7RNAP提供了重要的理论基础。

本研究为T7RNAP的改造开辟了新的方法和思路，同时为mRNA技术的发展注入了新的活力。通过减少dsRNA的生成，我们提高了mRNA的质量和安全性。凭借这一研究成果，我们成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNA Polymerase GMP-grade(low dsRNA, 250 U/μL)）。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，预示着mRNA技术的蓬勃发展，未来将为生物医学领域带来更多可能性。

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